Atelier 3
FRET par cytométrie en flux
Frédéric Larbret
Le transfert résonnant d’énergie de fluorescence (FRET) est un phénomène physique résultant d’une interaction dipôle-dipôle entre deux molécules (donneur et accepteur d’énergie). Pour qu’un signal FRET soit possible, il faut que ces deux molécules présentent des compatibilités énergétiques très précises, autrement dit, il faut que le spectre d’émission du donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d’absorption de l’accepteur. Dans ces conditions, et seulement si les deux molécules se trouvent à une distance inférieure à 100Å, on observera un transfert d’énergie du donneur vers l’accepteur. Sous excitation du donneur, ce transfert résonnant d’énergie de fluorescence se traduira alors par une émission de fluorescence de l’accepteur.
Ce principe physique est aujourd’hui très largement utilisé en biologie notamment pour analyser les interactions protéines-protéines. Cependant, cette utilisation est souvent restreinte à des analyses en microscopie et est beaucoup plus rarement appliqué en cytométrie en flux (CMF). Pourtant, la CMF offre de nombreux avantages ; c’est une technique d’analyse simple, rapide, permettant d’analyser des milliers de cellules en un lapse de temps très court (quelques secondes). De plus, la CMF est particulièrement adaptée aux cellules en suspensions contrairement aux techniques de microscopie.
Nous verrons donc au cours de cet atelier comment mettre en œuvre une expérience de FRET en CMF, dans quel cas cette approche par la CMF est un réel atout par rapport à une utilisation en microscopie. Nous nous intéresserons également aux différentes façons d’analyser un signal FRET en CMF (analyse par mesure d’intensité de fluorescence de l’accepteur et analyse ratiométrique) et comment quantifier ce signal. Enfin, Nous verrons quels sont les couples de FRET les plus adaptés, mais aussi les limites d’une analyse FRET en CMF et les artéfacts à éviter. Les expériences seront effectuées sur un cytomètre type Fortessa équipé de 4 lasers sur lequel nous utiliserons à la fois des sondes FRET intramoléculaires (l’accepteur et le donneur sont liés sur la même protéine. Le signal FRET émis est du à une modification de la conformation de la protéine) et intermoléculaires (l’accepteur et le donneur sont liés de part et d’autre à deux protéines distinctes qui pourront interagir et générer ainsi un signal FRET). Nous travaillerons principalement avec des couples de FRET dérivés de la GFP. Les stratégies utilisant des anticorps seront seulement évoquées.