Atelier 7
Méthode de standardisation des cytomètres pour la réalisation d’études longitudinales
Pierre Grenot et Lillia Hadjem
La standardisation a pour but de produire des résultats fiables et reproductibles au cours du temps. En neutralisant la variabilité de sensibilité des instruments à chaque acquisition, la standardisation du cytomètre va permettre de réduire les écarts de mesure entre les expériences et ainsi comparer de manière plus fine les résultats au cours du temps (pourcentage, moyenne de fluorescence...). Cette méthodologie de standardisation peut être utilisée pour transposer des réglages d’un instrument à un autre et permettre ainsi la comparaison des résultats obtenus sur deux machines différentes.
La standardisation comprend deux étapes fondamentales qui seront abordées lors de cet atelier :
- la caractérisation des cytomètres (résolution, sensibilité),
- les réglages et optimisation de la sensibilité des cytomètres.
L’atelier sera réalisé avec un FacsCanto10C BDTM sur lequel nous établirons une ligne de base avec des billes de calibration qui permettent de calculer le bruit de fond électronique (electronic noise) et optique (B optical background). Cette ligne de base servira à établir le réglage optimal de la sensibilité des photomultiplicateurs pour un type cellulaire en utilisant la règle des 2.5 rSDEN. La série de réglage permettra aux utilisateurs de recycler les mêmes réglages de base (application settings), de valider des concentrations d’anticorps monoclonaux et les indexes de marquages (stain index). La validation de cette méthode sera mise en évidence en dégradant les signaux de fluorescence détectés à l’aide de filtres de densité neutre afin de mimer les effets possibles liés à des altérations du matériel (baisse intensité laser, alignements optiques, filtres altérés...).
Nous pourrons ainsi prouver la robustesse d’un panel au cours du temps. L’utilité d’ajouter un contrôle interne de standardisation sera également abordée. Ce protocole de standardisation sera utilisé pour réaliser une standardisation entre deux cytomètres.
A l’issue de cet atelier, les participants auront un aperçu des phases clés d’une standardisation et de la caractérisation des performances applicables à tout type de cytomètres. Les participants sauront optimiser les réglages des PMTs du cytomètres et les fixer dans le temps pour parvenir à un protocole standardisé de marquage en cytométrie multi‐paramétrique.