JFPC 2018 - Thèmes des ateliers

Thèmes des ateliers

1 - ABC de la cytométrie - Durée de l’atelier : 1h30

Christelle Faveeuw (CIIL - Institut Pasteur, Lille)

L’objectif de cet atelier est de découvrir (pour les débutants) ou revisiter (pour les utilisateurs) la cytométrie en flux.

Principe général de la cytométrie en flux.
Fonctionnement d’un cytomètre en flux : nous aborderons entre autres la fluorescence, les lasers, les photomultiplicateurs (PMT), les compensations. Pour la partie analytique, nous discuterons de la présentation des résultats : Pourcentages, MFI (intensité moyenne de fluorescence).
Applications : quelques exemples : Phénotypage (Etablir une stratégie de gating) ; Prolifération ; cytokines intracellulaires…

2 - Standardisation : Méthode de standardisation des cytomètres pour la réalisation d'études longitudinales
Durée de l’atelier : 3h

Julie Cazareth (Valbonne), Pierre Grenot (Marseillle) et Julien Mafille (Miltenyi Biotec, Paris)

La standardisation a pour but de produire des résultats fiables et reproductibles au cours du temps. En neutralisant la variabilité de sensibilité des instruments à chaque acquisition, la standardisation du cytomètre va permettre de réduire les écarts de mesure entre les expériences et ainsi comparer de manière plus fine les résultats au cours du temps (pourcentage, moyenne de fluorescence…). Cette méthodologie de standardisation peut être utilisée pour transposer des réglages d’un instrument à un autre et permettre ainsi la comparaison des résultats obtenus sur deux machines différentes.

La standardisation comprend deux étapes fondamentales qui seront abordées lors de cet atelier :

la caractérisation des cytomètres (résolution, sensibilité)
les réglages et optimisation de la sensibilité des cytomètres

L’atelier sera réalisé avec un FacsCelesta BDTM sur lequel nous établirons une ligne de base avec des billes de calibration qui permettent de calculer le bruit de fond électronique (electronic noise) et optique (B optical background). Cette ligne de base servira à établir le réglage optimal de la sensibilité des photomultiplicateurs pour un type cellulaire en utilisant la règle des 2.5 rSDEN. La série de réglage permettra aux utilisateurs de recycler les mêmes réglages de base (application settings), de valider des concentrations d’anticorps monoclonaux et les indexes de marquage (stain index). La validation de cette méthode sera mise en évidence en dégradant artéfactuellement les signaux de fluorescence afin de mimer les effets possibles liés à des altérations du matériel (baisse intensité laser, alignements optiques, filtres altérés…).

Nous pourrons ainsi prouver la robustesse d’un panel au cours du temps. L’utilité d’ajouter un contrôle interne de standardisation sera également abordée.
Ce protocole de standardisation sera utilisé pour réaliser une standardisation entre le FacsCelesta (10 couleurs) équipé de 3 lasers et le CytoFlex S (10 couleurs) 3 lasers sur un panel constitué de 10 fluorochromes.

A l’issue de cet atelier, les participants auront un aperçu des phases clés d’une standardisation et de la caractérisation des performances applicables à tout type de cytomètre. Les participants sauront optimiser les réglages des PMTs du cytomètre et les fixer dans le temps pour parvenir à un protocole standardisé de marquage en cytométrie multi-paramétrique.

3 - Multi-couleurs (design protocoles) - Durée de l’atelier : 3h

Muriel Andrieu (Paris), Cyril Wilmes et Nicolas Zucchini (BD Life Sciences - Biosciences, Rungis)

Sélection des réactifs et sélection des contrôles pour l’analyse d’un panel multi-couleur permettant la détection d’antigènes faiblement exprimés et de cellules peu fréquentes.

L’atelier se compose de deux parties :

Première partie d’environ 1h30 : les principes de la sélection des réactifs en utilisant les indices de marquage ainsi que l’utilisation des contrôles pour l’analyse seront présentés.
Deuxième partie d’environ 1h30 : présentation, sous forme de démonstration, d’un outil en ligne d’aide à la conception et la validation des panels (BD Horizon™ Guided Panel Solution).

4 - Accréditation - Durée de l’atelier : 3h30

Michel Ticchioni (Nice)

Dossier de validation de méthode : cytométrie en flux appliquée aux hémopathies et aux désordres de l’immunité et à la numération lymphocytaire: retour d’expérience des groupes experts FranceFlow et GEIL

L’atelier a pour objectif de faire partager l’expérience et les recommandations du groupe de travail « accréditation en cytométrie en flux » de l’AFC pour la constitution du dossier de validation des méthodes SH-Form 43 « dépistage et caractérisation d’une hémopathie par cytométrie en flux » et « numération lymphocytaire par cytométrie en flux ».

L’atelier sera construit autour du SH-Form 43. Le groupe accréditation de l’AFC a mis à profit le travail et l’expérience des groupes experts FranceFlow et GEIL pour formuler un certain nombre de propositions visant à remplir les différents items du SH Form 43. Ces propositions seront discutées et débattues avec l’ensemble des participants et pourront selon les cas être adaptées aux spécificités locales. Selon les demandes des participants d’autres aspects pourront être discutés comme la maladie résiduelle ou la mesure des progéniteurs des cellules souches hématopoiètiques.

Le groupe FranceFlow réunit 21 laboratoires français et belges d’hématologie et d’immunologie spécialisés en phénotypage multicouleurs des leucémies et lymphomes. Outre la standardisation des machines, le groupe travaille depuis plusieurs années à l’harmonisation des pratiques quotidiennes dans le cadre du phénotypage des hémopathies malignes.

Le Groupe d’Etude Immunologique des Leucémies, créé en 1984, regroupe de nombreux laboratoires d’hématologie et d’immunologie français et belges et est à l’origine de très nombreuses études portant notamment sur la caractérisation immunophénotypique des leucémies et lymphomes.

5 - ISO 9001 - Durée de l’atelier : 3h

Yousra Lottin (Paris)

6 - ImageStream acquisition - Durée de l’atelier : 3h

Hélène Bauderlique (Lille)

L’imageur en flux allie les compétences statistiques de la cytométrie en flux et l’information spatiale obtenue en microscopie photonique.

Après une description brève du système et de ses propriétés et des différentes applications possibles, l’atelier développera les différentes étapes pour préparer et procéder à l’acquisition d’échantillons.

7 - ImageStream analyse jeu de données - Durée de l’atelier : 1h30

Hélène Bauderlique (Lille)

Cet atelier va permettre aux participants de se familiariser avec le logiciel IDEAS pour analyser des échantillons enregistrés sur l’imageur en flux ImageStream. Ce logiciel spécifique permet de faire une analyse classique de cytométrie en flux (avec des histogrammes, des dot plots et des valeurs statistiques) combinée à l’analyse d’image pour les localisations, comptage de spots… Chaque participant aura accès à un jeu de données qu’il pourra traiter sur un ordinateur mis à sa disposition.

8 - Cytométrie acoustique - Durée de l’atelier : 1h30 (Annulé)

9 - Cytométrie spectrale - Durée de l’atelier : 1h30

Thierry Idziorek (Lille), Xavier Dezitter (Lille) et Cédric Aït-Mansour (Weybridge, Surrey, USA)

La cytométrie spectrale est un nouveau type de cytométrie qui s’affranchit des filtres habituels pour enregistrer la lumière émise sur tout le spectre visible. L’objectif de l’atelier est de faire découvrir la technologie, ses avantages et ses contraintes. Sur le plan pratique, on montrera comment effectuer un phénotypage multicouleurs et comment utiliser les capacités de l’appareil pour faire abstraction de la fluorescence naturelle de composés chimiques activateurs ou inhibiteurs des cellules.

10 - Cytométrie de Masse (présentations et applications) - Durée de l’atelier : 1h30

Olivier Molendi-Coste et Pineau Laurent (Lille)

La cytométrie de masse est devenue une technique de référence pour l’étude du phénotype et de la fonctionnalité cellulaire.

D’une part, le marquage des anticorps avec des isotopes hautement purifiés de métaux telluriques et leur détection par un spectromètre de masse à temps de vol offre de nombreux avantages comparativement à la cytométrie fluorescente en flux, que ce soit au niveau :

du bruit de fond très réduit,
de l’absence quasi-totale de débordement des signaux d’un canal à l’autre,
de la résistance du polymère aux fixateurs ce qui en fait un outil idéal pour l’étude des mécanismes intracellulaires.

D’autre part, cette technologie permet d’augmenter considérablement le nombre de cibles étudiées, avec à l’heure actuelle jusqu’à 47 labels (couplages) possibles.

Enfin, le développement d’une communauté d’utilisateurs, la standardisation des panels et des marquages à l’aide de billes, ainsi que la possibilité de « bar-coder » les échantillons en fait un outil accessible, puissant pour les études longitudinales/cliniques et d’une reproductibilité maximale.

L’analyse des données multiparamétriques comme celles issues de la cytométrie de masse peut se réaliser de façon classique. Le développement d’algorithmes de plus en plus performants d’analyse non supervisée assistée par ordinateur est en plein essor dans la littérature et permet l’identification optimisée des populations/sous-populations rares et d’intérêt.

11 - Reproductibilité et BP en CMF - Durée de l’atelier : 1h30

Florent Dumezy (Lille)

L’objectif de cet atelier de 1h30 est de connaître les sources de variations analytiques afin de pouvoir les minimiser et de réaliser par exemple : des comparaisons qualitatives ou quantitatives de résultats, des merges de fichiers FCS ou de préparer un argumentaire pour l’accréditation.

Cet atelier est destiné aux personnes désirant avancer dans la détection des pièges de la cytométrie. Seront abordés les facteurs de variation intervenants depuis la prise en charge de l’échantillon jusqu’à l’analyse des données en prenant en exemples des analyses d’hématologie cellulaire :

A - Facteurs liés à l’échantillon et aux méthodologies d’immunomarquages.
B - Facteurs de variation associés au cytomètre : son réglage et la conservation de ce dernier.
C - Éléments à observer lors de l’analyse pour contrôler la qualité de la technique.

12 - Atelier clonage (single cell) - Durée de l’atelier : 3h

Muriel Andrieu (Paris), Thierry Langlois (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix) et Émilie Floquet (Lille)

Le tri par cytométrie en flux est un outil robuste pour enrichir ou purifier une population cellulaire d’intérêt. La technologie majoritairement utilisée par les fournisseurs se base sur le déflection par un champ électrostatique de microgouttelettes contenant les cellules d’intérêt. La distribution de ces microgouttelettes pouvant s’effectuer en tube ou en plaque, il est donc possible de réaliser un clonage, c’est-à-dire, déposer une microgouttelette contenant une cellule unique d’intérêt dans un puits bien identifié. Le tri à l’échelon unicellulaire est d’autant plus d’actualité suite à l’émergence de techniques de biologie moléculaire permettant de travailler sur une entité unique et d’apporter ainsi plus de profondeur dans les analyses.

L’objectif de cet atelier est donc d’aborder les bonnes pratiques pour réussir un clonage. Nous détaillerons les réglages instrument nécessaires, les techniques de control de la précision de distribution en plaque, l’efficacité de tri et l’efficacité de clonage, ainsi que l’analyse « Index Sort ».

13 - Microparticules - Durée de l’atelier : 1h30

Mickael Bourge (Gif-sur-Yvette) et Emeric Deruy (ACEA BioSciences)

Lors de cet atelier, nous aborderons les difficultés à analyser des évènements inférieurs à 1 µm. Quels sont les paramètres optiques et fluidiques à considérer, l’importance du seuillage et du déclencheur, comment peut-on utiliser le “back-gating” pour avoir une meilleure résolution de nos analyses.

Pour illustrer cette thématique, nous analyserons des mitochondries taggées GFP (29 premiers aa du cytochrome c oxidase IV de Saccharomyces cerevisiae) à partir de plantules d’Arabidopsis thaliana. Nous verrons comment différencier une population de chloroplastes d’une population de mitochondries et quelle est leur signature respective en scatter.

Cet atelier thématique, réalisé sur le NovoCyte (ACEA Biosciences), apportera toutes les clés nécessaires à la mise en place de projets similaires dans vos laboratoires. Un panel de données utilisant les stratégies enseignées lors de cet atelier sera également présenté pour des champs d’application tels que sont la microbiologie (terrestre ou marine), les nanoparticules ou encore l’analyse de vésicules extracellulaires.

14 - Apoptose - Durée de l’atelier : 1h30

Thierry Idziorek (Lille)

L’apoptose est un processus biologique impliqué dans la morphogénèse et le remodelage de structures. Elle est également impliquée dans de nombreuses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer dans lesquelles on observe soit une augmentation, soit un défaut de mort cellulaire. Ces phénomènes sont programmés et mettent en jeu dans la cellule de nombreux mécanismes. La cytométrie a un rôle important dans la caractérisation de ce type de mort cellulaire. Après un bref rappel sur l’apoptose et ses mécanismes, l’objectif de l’atelier sera de visualiser des altérations de l’intégrité de la membrane plasmique et du potentiel mitochondrial ainsi que l’activation de caspases.

15 - Dosage de biomarqueurs en multiplex - Durée de l’atelier : 3h

Karine Bailly (Paris)

La technologie Meso Scale Discovery (MSD) permet la détection de biomarqueurs en format simplex et multiplex, en plaques 96-puits et 384-puits. Elle offre une bonne alternative aux essais LuminexT et CBA® pour étudier l’inflammation (cytokines et chimiokines), les phosphoprotéines et la signalisation intracellulaire, le cancer, les biomarqueurs vasculaires et de l’angiogénèse, le métabolisme, les maladies neurodégénératrices, etc.

Utilisant l’électrochemiluminescence, ces essais offrent une forte sensibilité et une gamme dynamique large allant jusqu’à 5 logs. Ils utilisent un petit volume d’échantillon et tolèrent bien les matrices complexes, permettant de travailler avec du serum/plasma, des surnageants cellulaires, des lysats cellulaires, des homogénats de tissus et tumeurs, de l’urine, du Lavage broncho-alvéolaire (LBA), du liquide céphalorachidien (LCR), etc.

La sensibilité et la gamme dynamique des essais permettent de mesurer le niveau des biomarqueurs dans des échantillons sains (basal) versus malades sans avoir à faire de multiples dilutions, ce qui, combiné au multiplex, permet d’économiser du temps, de l’échantillon tout en réduisant le coût de l’essai. Durant l’atelier, après une brève introduction à la technologie de l’électrochemiluminescence, nous apprendrons à utiliser un kit MSD cytokines multiplex. Enfin, nous réaliserons l’exploitation des données afin de tracer les gammes et calculer la concentration des échantillons.

16-1 - Microbiologie 1 : Dénombrement - Durée de l’atelier : 1h30

Marielle Bouix (AgroParisTech INRA), Pierre Burguiere (AMA-Research Solutions) et Sarrah Ghorbal (AgroParisTech INRA)

Un des grands intérêt de la cytométrie en flux en microbiologie est le délai court de réponse par rapport à la méthode traditionnelle de culture. Il est possible de dénombrer les microorganismes directement dans la suspension ou après un marquage de viabilité. Dans ce cas, suivant les marqueurs, on pourra dénombrer les microorganismes viables parmi la population totale, ou les microorganismes viables, altérées et morts.

Dans cet atelier, seront réalisés :

un dénombrement des germes totaux sans marquage sur un ferment, et le dénombrement de ferments lactiques viables selon la norme ISO,
un dénombrement des germes totaux viables dans du lait,
un dénombrement de levures viables (Saccharomyces) en début de fermentation d'un vin, et de levures viables et mortes dans un vin en fin de fermentation.

Les 2 types de marquage : Live/dead® et cFDA/IP seront présentés suivant les exemples (les exemples sont donnés à titre indicatif).

16-2 - Microbiologie 2 : Détection - Durée de l’atelier : 1h30

Marielle Bouix (AgroParisTech INRA), Pierre Burguiere (AMA-Research Solutions) et Sarrah Ghorbal (AgroParisTech INRA)

Un des grands intérêt de la cytométrie en flux en microbiologie est le délai court de réponse par rapport à la méthode traditionnelle de culture. Par ailleurs, il est possible de rendre la détection spécifique avec des anticorps, des sondes nucléiques, ou de détecter une transformation génétique si le gène d’intérêt a été couplé à une protéine fluorescente (GFP).

Dans cet atelier, seront réalisés :

une détection spécifique d’E. coli à l’aide d’un anticorps,
une détection spécifique d’Alicyclobacillus spp. ou Alicyclobacillus acidoterrestris dans un jus de fruit,
une détection de bactérie exprimant un gène couplé à une GFP.

Les expérimentations nécessitant des incubations, ou utilisant des microorganismes pathogènes seront présentées sur films.

16-3 - Microbiologie 3 : Fonctionnalités microbiennes - Durée de l’atelier : 1h30

Marielle Bouix (AgroParisTech INRA), Pierre Burguiere (AMA-Research Solutions) et Sarrah Ghorbal (AgroParisTech INRA)

En microbiologie positive (ferments, produits fermentés et biotechnologie blanche), l’état physiologique du microorganisme-outil est fondamental.

La cytométrie en flux, couplée à des marqueurs fluorescents permet de caractériser rapidement et simplement l’état cellulaire des microorganismes, ce qui permet en recherche d'optimiser les conditions du procédé en vue de le maintenir le plus actif possible, et en production industrielle, d’évaluer le bon fonctionnement du procédé et d'identifier les moments clé. On peut ainsi évaluer la vitalité cellulaire (activité spécifique), mais aussi des paramètres membranaires comme l’intégrité, le potentiel trans-membranaire, la fluidité membranaire, la membrane conditionnant le fonctionnement cellulaire. On peut aussi mesurer le pH intracellulaire qui avec le potentiel transmembranaire joue un rôle important dans les échanges (force proton motrice).

Dans cet atelier seront présentés l’évolution des paramètres d’état cellulaire d’une levure au cours d’une fermentation alcoolique :

l’évolution de la viabilité et de l’intégrité membranaire,
la mesure de la vitalité cellulaire,
l’évaluation du potentiel de membrane,
la mesure de la fluidité membranaire par anisotropie de fluorescence.

17 - Cycle cellulaire : initiation au principe et à la réalisation - Durée de l’atelier : 3h

Xavier Ronot (Lyon) - Biosciences & Co (Lyon)

L’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux ne faiblit pas au cours du temps notamment dans le domaine de la pharmacotoxicologie. Le marquage stœchiométrique de l’ADN par différents types de fluorochromes permet de connaître la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle. L’estimation des effectifs dans ces phases dépend du coefficient de variation des pics G0/1 et G2+M mais également de la méthode employée (miroir, gaussiennes,....) via les logiciels d’analyse.

L’analyse biparamétrique permet de s’affranchir des limites de celle du simple contenu en ADN et d’obtenir des informations complémentaires sur le cycle cellulaire pour distinguer les cellules en G0, G1, G2 et M. Elle consiste à combiner la mesure du contenu en ADN avec différents paramètres caractéristiques de la synthèse d’ADN (BrdU - EdU) ou de la présence de protéines particulières, directement associées ou non au phénomène prolifératif (antigène Ki67, histone H3 phosphorylée par exemple).

Cet atelier comprendra :

Des informations sur les fluorochromes de l’ADN, la discrimination des doublets et agrégats et les méthodes permettant de déterminer la fraction de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire ;
L’analyse d’échantillons au cytomètre après incorporation d’EdU et marquage de l’ADN ;
Des travaux tutorés interactifs présentant différentes situations expérimentales et destinés à évoquer les bonnes pratiques de préparation des échantillons, les limites et certains pièges rencontrés.

Références :

Critical aspects in analysis of cellular DNA content. Darzynkiewicz Z. Curr Protoc Cytom. 2010; Chapter 7: Unit7.2.
Cytométrie en flux et cycle cellulaire. D. Grunwald, J.F Mayol & X. Ronot (eds) ; 2010, Tec & Lavoisier, Paris.
Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. Gerdes J et al. J Immunol. 1984 ; 133(4):1710-1715. PMID: 6206131.
Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.Buck SB et al. A. Biotechniques. 2008; 44(7): 927-929. PMID: 18533904.
A new biomarker for mitotic cells. Jacobberger JW et al. Cytometry A. 2008; 73(1): 5-15. PMID: 18061938.

18 - Infinicyt - Durée de l’atelier : 1h30

Beatriz Ledo (Salamanca, Espagne) et Nathalie Jouy (Lille)

Infinicyt is a complete flow cytometry software which allows working with all kind of files including files from mass and spectral cytometry. It works with principal components and has special and unique features as:

APS (Automatic Population Separator): considers all parameters for the best separation possible providing parameter significance information for this segregation.
File Merge: allows combining several files into one file to perform global analysis and straightforward data interpretation.
Clustering: automatically connects and relates all events of a sample and divides them into groups (clusters) according to their relevance distance in the multidimensional space.
Maturation: tool designed for the study of variations in expression of different markers within different cell stages and their comparison with establish normal patterns.
Reference Image: tool whereby images and statistics from a specific condition can be stored and later loaded for comparison with a future case study.
Compass: it allows the comparison of a sample against your own reference database (composed of known cases) in order to orientate towards a panel.
EuroFlowTM Database Connection: given access to the EuroFlowTM databases, which are classified using tools as Automatic Gating & Identification (AG&I) and Compass Classification for ALOT (Acute Leukemic Orientation Tube), Multiple Myeloma-Minimal Residual Disease (MM-MRD) and Primary Immunodeficiencies (PID).
Offline Compensation: the user can modify an already compensation file or even perform an automatic (offline) compensation using compensation controls including unstained sample.

19 - CytofKit (présentation et applications) - Durée de l’atelier : 1h30

Olivier Molendi-Coste et Laurent Pineau (Lille)

La cytométrie de masse est devenue une technique de référence pour l’étude du phénotype et de la fonctionnalité cellulaire.

L’analyse des données multiparamétriques comme celles issues de la cytométrie de masse peut se réaliser de façon classique. Cependant, le développement d’algorithmes de plus en plus performants d’analyse non supervisée assistée par ordinateur est en plein essor dans la littérature et permet l’identification optimisée des populations/sous-populations rares et d’intérêt.

Parmi ces algorithmes se distinguent deux domaines principaux :

la réduction de dimension qui permet à la fois une analyse groupée de nombreux paramètres et une visualisation intelligible des différences entre cellules et groupes de cellules ;
le clustering ou identification des populations cellulaires sur la base de l’analyse simultanée de nombreux paramètres.

Les algorithmes de réduction de dimension visent à rassembler les événements les plus similaires et représentent ces événements le plus souvent en 2 dimensions. t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) semble être l’algorithme le plus performant pour l’analyse des données de cytométrie.
Les algorithmes de clustering sont nombreux, et, en fonction des jeux de données, présentent des performances variables d’un algorithme à l’autre en terme de regroupement des cellules similaires sur la base des n dimensions sélectionnées, de vitesse d’exécution, et de reproductibilité. L’utilisation de plusieurs algorithmes en parallèle permet de corroborer les résultats obtenus. Parmi ceux-ci, Rphenograph et ClusterX semblent les plus performants pour l’analyse des données de cytométrie.

Le kit « CyotfKit » développé sous « R » regroupe les algorythmes t-SNE, Rphenograph et ClusterX, et nous verrons qu’il est relativement facile d’accès.

20 - R-SHINY utilisation - Durée de l’atelier : 1h30 (Annulé)

Quentin Barbier (Marseille)

Depuis quelques années, les sciences de la vie vivent une révolution appuyée sur le développement explosif des nouvelles techniques de cytométrie. Le nombre d’éléments mesurés et la quantité de données sont devenus très importants. Répondre de façon satisfaisante à cette demande est une nécessité. De nos jours, la bio-informatique joue un rôle central dans les sciences du vivant pour gérer cette complexité. Le langage de programmation R en est un élément clé. Plus de 1000 librairies sont maintenant disponibles pour l’analyse, la visualisation ou le traitement des données de cytométrie. La grande majorité des outils disponible fonctionne en "ligne de commande" ce qui rend leur utilisation limitée aux initiés à la programmation. Le développement d’interfaces ergonomiques de ces outils bio-informatiques pour les biologistes est un réel besoin afin d’accélérer la démocratisation de ces nouvelles approches d’analyses de données à l’ensemble de la communauté de cytométristes. La librairie R shiny permet aux développeurs de créer des interfaces dynamiques grâce à un langage orienté web. Cette nouvelle librairie ouvre un nouveau champ de développement dans la bio-informatique à savoir l’interfaçage d’outil. Le but est de rendre l’utilisation des outils ergonomique, intuitif et les visualisations dynamiques. L’utilisation de ces outils requiert une initiation minime à l’utilisation de R.

Dans le cadre de cet atelier pratique, les participants vont apprendre à :

Installer de nouvelles librairies R provenant de différentes sources.
Lancer de différentes manières des outils shiny.
Visualiser différentes méthodes de transformation des données et leur impact sur l’utilisation d’outils d’analyse avancée en cytométrie.
Analyser la qualité d'un fichier FCS.
Annoter des populations grâce à SCAFFOLD.

21 - Cytobank - Durée de l’atelier : 1h30

Patrice Vallin (Paris)

22 - FlowJo - Durée de l’atelier : 1h30

Patrice Vallin (Paris)

L’augmentation du nombre de dimension dans les données de cytométrie de flux remet en question les stratégies d’analyse traditionnelles des populations cellulaires et l'interrogation de leurs propriétés phénotypiques et fonctionnelles.

Dans cet atelier, nous verrons comment utiliser le logiciel FlowJo afin d’étudier des données de cytométrie en haute dimension par une approche supervisée, ou non-supervisée.

Dans la première partie, nous réaliserons un contrôle qualité des données et l’élimination des évènements indésirables par les outils flowClean, ou FlowAI. Puis, nous verrons comment créer une matrice de compensation et l’appliquer. Enfin, nous produirons une stratégie d’analyse reproductible à l’ensemble de nos échantillons et nous extrairons les graphiques et les statistiques associées.

Dans une seconde partie, nous utiliserons FlowJo pour générer des analyses non supervisées via les outils de réduction dimensionnelle (tSNE), et de clusterisation (FlowSOM).

23 - Kaluza™ Durée de l’atelier : 1h30

Benoit Dupont (Villepinte) et Nathalie Jouy (Lille)

Lors de cet atelier Kaluza, nous aurons l’occasion de vous montrer les capacités de ce logiciel intuitif pour le retraitement classique et non supervisé des données de cytométrie en flux.

Nous aborderons les thématiques telles que la construction d’un arbre Tree Plot afin d’afficher les combinaisons des marqueurs sélectionnés, les overlays, la fusion de fichiers et son utilité pour l’affichage des données, le comparaison plot, le module de cycle cellulaire, l’analyse en batch, le module de calcul automatique des compensations et le Plug-In R pour l’analyse non supervisée (PCA, t-sne, SPADE, FlowSOM,…).
Au plaisir de vous y rencontrer. Benoit Dupont, Beckman Coulter

25 - Myélodysplasie - Durée de l’atelier : 1h30

Lydia Campos et Carmen Aanei (Saint-Étienne)

Le but de l’atelier est d'assurer une présentation générale sur l’intérêt diagnostique des myélodysplasies par cytométrie en flux et de présenter une nouvelle stratégie d’analyse des données immunophénotypiques des lignées myéloïdes afin de pouvoir intégrer ces données dans le cadre d’un bilan de diagnostic de Syndrome Myélodysplasique (SMD).

Après présentation des données de la littérature et des principes théoriques, les participants pourront visualiser des analyses de cas guidées par des bases de données de moelles normales pour les exercer à identifier des anomalies phénotypiques liées à la dysplasie.

L’objectif est de sensibiliser les participants aux écueils et aux exigences techniques afin d’obtenir des données comparables avec une base de données, ainsi que l’importance de s’appuyer sur des bases de données de moelles normales pour évaluer les anomalies phénotypiques liées à la dysplasie.

La forte demande des cliniciens pour optimiser le diagnostic de SMD est justifiée par la nécessité d’initiation précoce du traitement afin d’assurer l’indépendance transfusionnelle autant que possible, prolonger la survie et améliorer les pronostics de ces patients.

26 - Lymphomes / Myélomes : Cytométrie en flux sur prélèvements tissulaires - Durée de l’atelier : 1h30

Mikaël Roussel (Rennes)

L’approche par cytométrie de flux sur tissus participe au diagnostic des lymphomes.
Dans cet atelier, nous vous proposons une partie théorique sur les aspects préanalytiques spécifiques (par exemple: conditions d’acheminement, techniques de dissociation). Dans un second temps, nous analyserons une série de cas obtenus à partir de machines Navios (Beckman Coulter) et Lyric (Becton Dickinson).

27 - Maladie résiduelle cellules souches LAM - Durée de l’atelier : 3h

Adriana Plesa (Lyon), Florent Dumezy (Lille) et Christophe Roumier (Lille)

Les objectifs de cet atelier sont de donner les bases et d’approfondir vos connaissances nécessaires à la réalisation en pratique quotidienne de laboratoire du suivi de la maladie résiduelle des LAM par cytométrie multiparamétrique.

Première partie : bases théoriques : après une introduction présentant les recommandations récentes proposées par l’ELN et leurs applications proposées par le groupe ALFA MRD LAM, nous aborderons les thèmes suivants : définition des LAIP (leukemia aberrant immunophenotype), mise en évidence des LSC (leukemia stem cells) et intérêt au diagnostic et dans le suivi des LAM.
Deuxième partie : les stratégies d’analyses (LAIP, différent du normal et LSC), définition des seuils de sensibilité, mode de rendu des résultats : les participants réaliseront en pratique sur logiciels Diva ou Kaluza l’analyse de différents dossiers : (i) Moelle normale, (ii) LAM au diagnostic, (iii) Différents points de suivi de la MRD.
Troisième partie : Table ronde autour de cette application, synthèse des principaux points abordés, perspectives Infinicyt et FlowSom.

28 - Maladie résiduelle LLC - Durée de l’atelier : 3h

Rémi Letestu (Bobigny)

L’étude de la maladie résiduelle (MRD) prend une place grandissante dans le suivi des patients traités pour une leucémie lymphoïde chronique (LLC). Il y a encore quelques années, cette analyse était considérée comme une étude ancillaire dans les essais cliniques, puis elle a été utilisée comme indicateur de réponse au traitement, sa signification pronostique a été validée dans les essais cliniques, et elle a également servi pour la stratification des patients candidats à un traitement de consolidation.

Actuellement, la valeur pronostique des tests haute sensibilité se confirme après immunochimiothérapie et permet d’envisager son utilisation dans la prise de décision thérapeutique. Le statut de la MRD peut être employé pour poser l’indication d’une ré-intervention thérapeutique mais surtout pour décider de l’interruption d’un traitement au long cours. Cette dernière application est particulièrement importante s’agissant des nouvelles thérapies ciblées comme les inhibiteurs du BCR ou les BH3 mimétiques comme les inhibiteurs de Bcl-2.

Jusqu’à présent, les recommandations stipulent qu’il n’y a pas d’indication à tester la MRD en dehors des essais cliniques. Cependant, l’évolution des pratiques et les nouvelles applications de la MRD suggèrent un passage prochain de ce test dans le domaine des analyses biologiques spécialisées. Dans ce contexte il semble important que des techniques de MRD sensibles et standardisées soient accessibles afin de répondre à une prochaine demande des cliniciens.

Dans cet atelier nous vous proposons une première partie théorique avec un rappel sur les notions de base de la MRD, l’évolution des techniques et de leurs performances, l’interprétation des résultats et leur formulation. Après une petite pause bienvenue, une seconde partie pratique vous proposera une série de cas à analyser afin de vous familiariser avec le profil d’expression des marqueurs de suivi de la LLC et leur fenêtrage. Enfin, nous pourrons réserver un temps d’échange autour de situations pratiques apportées par les participants. Donc, si vous avez des questions relatives à un cas, n’hésitez pas à me les adresser au plus tard le 15 mai à l’adresse suivante remi.letestu@aphp.fr afin que je puisse les préparer à l’avance.

Au plaisir de vous accueillir nombreux dans cet atelier en juin prochain…
Bien cytométriquement vôtre !