JFPC 2018

5-6 juin 2018, Faculté de Médecine Henri Warembourg - Pôle Recherche, Lille

Bandeau - JFPC 2018

Thèmes des ateliers

1 - ABC de la cytométrie - Durée de l’atelier : 1h30

Christelle Faveeuw (CIIL - Institut Pasteur, Lille)

L’objectif de cet atelier est de découvrir (pour les débutants) ou revisiter (pour les utilisateurs) la cytométrie en flux.


2 - Standardisation - Durée de l’atelier : 3h

Julie Cazareth (Valbonne) et Pierre Grenot (Marseillle)


3 - Multi-couleurs (design protocoles) - Durée de l’atelier : 3h

Muriel Andrieu (Paris), Cyril Wilmes et Nicolas Zucchini (BD Life Sciences - Biosciences, Rungis)

Sélection des réactifs et sélection des contrôles pour l’analyse d’un panel multi-couleur permettant la détection d’antigènes faiblement exprimés et de cellules peu fréquentes.

L’atelier se compose de deux parties :


4 - Accréditation - Durée de l’atelier : 3h

Michel Ticchioni (Nice)


5 - ISO 9001 - Durée de l’atelier : 3h

Yosra Lotin


6 - Imagestream acquisition (intro machine + acquisition + 1ère analyse) - Durée de l’atelier : 3h


8 - Cytométrie acoustique - Durée de l’atelier : 1h30


9 - Cytométrie spectrale - Durée de l’atelier : 1h30

Thierry Idziorek (Lille), Xavier Dezitter (Lille) et Cédric Aït-Mansour (Weybridge, Surrey, USA)

La cytométrie spectrale est un nouveau type de cytométrie qui s’affranchit des filtres habituels pour enregistrer la lumière émise sur tout le spectre visible. L’objectif de l’atelier est de faire découvrir la technologie, ses avantages et ses contraintes. Sur le plan pratique, on montrera comment effectuer un phénotypage multicouleurs et comment utiliser les capacités de l’appareil pour faire abstraction de la fluorescence naturelle de composés chimiques activateurs ou inhibiteurs des cellules.


10 - Cytométrie de Masse (présentations et applications) - Durée de l’atelier : 1h30

Olivier Molendi-Coste et Pineau Laurent (Lille)

La cytométrie de masse est devenue une technique de référence pour l’étude du phénotype et de la fonctionnalité cellulaire.

D’une part, le marquage des anticorps avec des isotopes hautement purifiés de métaux telluriques et leur détection par un spectromètre de masse à temps de vol offre de nombreux avantages comparativement à la cytométrie fluorescente en flux, que ce soit au niveau :

D’autre part, cette technologie permet d’augmenter considérablement le nombre de cibles étudiées, avec à l’heure actuelle jusqu’à 47 labels (couplages) possibles.

Enfin, le développement d’une communauté d’utilisateurs, la standardisation des panels et des marquages à l’aide de billes, ainsi que la possibilité de « bar-coder » les échantillons en fait un outil accessible, puissant pour les études longitudinales/cliniques et d’une reproductibilité maximale.

L’analyse des données multiparamétriques comme celles issues de la cytométrie de masse peut se réaliser de façon classique. Le développement d’algorithmes de plus en plus performants d’analyse non supervisée assistée par ordinateur est en plein essor dans la littérature et permet l’identification optimisée des populations/sous-populations rares et d’intérêt.


11 - Reproductibilité et BP en CMF - Durée de l’atelier : 1h30

Florent Dumezy (Lille)

L’objectif de cet atelier de 1h30 est de connaître les sources de variations analytiques afin de pouvoir les minimiser et de réaliser par exemple : des comparaisons qualitatives ou quantitatives de résultats, des merges de fichiers FCS ou de préparer un argumentaire pour l’accréditation.

Cet atelier est destiné aux personnes désirant avancer dans la détection des pièges de la cytométrie. Seront abordés les facteurs de variation intervenants depuis la prise en charge de l’échantillon jusqu’à l’analyse des données en prenant en exemples des analyses d’hématologie cellulaire :


12 - Atelier clonage (single cell) - Durée de l’atelier : 3h

Muriel Andrieu (Paris) et Thierry Langlois (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix)

Le tri par cytométrie en flux est un outil robuste pour enrichir ou purifier une population cellulaire d’intérêt. La technologie majoritairement utilisée par les fournisseurs se base sur le déflection par un champ électrostatique de microgouttelettes contenant les cellules d’intérêt. La distribution de ces microgouttelettes pouvant s’effectuer en tube ou en plaque, il est donc possible de réaliser un clonage, c’est-à-dire, déposer une microgouttelette contenant une cellule unique d’intérêt dans un puits bien identifié. Le tri à l’échelon unicellulaire est d’autant plus d’actualité suite à l’émergence de techniques de biologie moléculaire permettant de travailler sur une entité unique et d’apporter ainsi plus de profondeur dans les analyses.

L’objectif de cet atelier est donc d’aborder les bonnes pratiques pour réussir un clonage. Nous détaillerons les réglages instrument nécessaires, les techniques de control de la précision de distribution en plaque, l’efficacité de tri et l’efficacité de clonage, ainsi que l’analyse « Index Sort ».


13 - Microparticules - Durée de l’atelier : 1h30

Mickael Bourge (Gif-sur-Yvette) et Emeric Deruy (ACEA BioSciences)

Lors de cet atelier, nous aborderons les difficultés à analyser des évènements inférieurs à 1 µm. Quels sont les paramètres optiques et fluidiques à considérer, l’importance du seuillage et du déclencheur, comment peut-on utiliser le “back-gating” pour avoir une meilleure résolution de nos analyses.

Pour illustrer cette thématique, nous analyserons des mitochondries taggées GFP (29 premiers aa du cytochrome c oxidase IV de Saccharomyces cerevisiae) à partir de plantules d’Arabidopsis thaliana. Nous verrons comment différencier une population de chloroplastes d’une population de mitochondries et quelle est leur signature respective en scatter.

Cet atelier thématique, réalisé sur le NovoCyte (ACEA Biosciences), apportera toutes les clés nécessaires à la mise en place de projets similaires dans vos laboratoires. Un panel de données utilisant les stratégies enseignées lors de cet atelier sera également présenté pour des champs d’application tels que sont la microbiologie (terrestre ou marine), les nanoparticules ou encore l’analyse de vésicules extracellulaires.


14 - Apoptose - Durée de l’atelier : 3h

Thierry Idziorek (Lille)

L’apoptose est un processus biologique impliqué dans la morphogénèse et le remodelage de structures. Elle est également impliquée dans de nombreuses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer dans lesquelles on observe soit une augmentation, soit un défaut de mort cellulaire. Ces phénomènes sont programmés et mettent en jeu dans la cellule de nombreux mécanismes. La cytométrie a un rôle important dans la caractérisation de ce type de mort cellulaire. Après un bref rappel sur l’apoptose et ses mécanismes, l’objectif de l’atelier sera de visualiser des altérations de l’intégrité de la membrane plasmique et du potentiel mitochondrial ainsi que l’activation de caspases.


15 - Dosage de biomarqueurs en multiplex
Durée de l’atelier : 3h


16-1 - Microbiologie 1 : Dénombrement - Durée de l’atelier : 1h30

Marielle Bouix (AgroParisTech INRA), Pierre Burguiere (AMA-Research Solutions) et Sarrah Ghorbal (AgroParisTech INRA)

Un des grands intérêt de la cytométrie en flux en microbiologie est le délai court de réponse par rapport à la méthode traditionnelle de culture. Il est possible de dénombrer les microorganismes directement dans la suspension ou après un marquage de viabilité. Dans ce cas, suivant les marqueurs, on pourra dénombrer les microorganismes viables parmi la population totale, ou les microorganismes viables, altérées et morts.

Dans cet atelier, seront réalisés :

Les 2 types de marquage : Live/dead® et cFDA/IP seront présentés suivant les exemples (les exemples sont donnés à titre indicatif).


16-2 - Microbiologie 2 : Détection - Durée de l’atelier : 1h30

Marielle Bouix (AgroParisTech INRA), Pierre Burguiere (AMA-Research Solutions) et Sarrah Ghorbal (AgroParisTech INRA)

Un des grands intérêt de la cytométrie en flux en microbiologie est le délai court de réponse par rapport à la méthode traditionnelle de culture. Par ailleurs, il est possible de rendre la détection spécifique avec des anticorps, des sondes nucléiques, ou de détecter une transformation génétique si le gène d’intérêt a été couplé à une protéine fluorescente (GFP).

Dans cet atelier, seront réalisés :

Les expérimentations nécessitant des incubations, ou utilisant des microorganismes pathogènes seront présentées sur films.


16-3 - Microbiologie 3 : Fonctionnalités microbiennes - Durée de l’atelier : 1h30

Marielle Bouix (AgroParisTech INRA), Pierre Burguiere (AMA-Research Solutions) et Sarrah Ghorbal (AgroParisTech INRA)

En microbiologie positive (ferments, produits fermentés et biotechnologie blanche), l’état physiologique du microorganisme-outil est fondamental.

La cytométrie en flux, couplée à des marqueurs fluorescents permet de caractériser rapidement et simplement l’état cellulaire des microorganismes, ce qui permet en recherche d'optimiser les conditions du procédé en vue de le maintenir le plus actif possible, et en production industrielle, d’évaluer le bon fonctionnement du procédé et d'identifier les moments clé. On peut ainsi évaluer la vitalité cellulaire (activité spécifique), mais aussi des paramètres membranaires comme l’intégrité, le potentiel trans-membranaire, la fluidité membranaire, la membrane conditionnant le fonctionnement cellulaire. On peut aussi mesurer le pH intracellulaire qui avec le potentiel transmembranaire joue un rôle important dans les échanges (force proton motrice).

Dans cet atelier seront présentés l’évolution des paramètres d’état cellulaire d’une levure au cours d’une fermentation alcoolique :


17 - Cycle cellulaire : initiation au principe et à la réalisation - Durée de l’atelier : 3h

Xavier Ronot (Lyon) - Biosciences & Co (Lyon)

L’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux ne faiblit pas au cours du temps notamment dans le domaine de la pharmacotoxicologie. Le marquage stœchiométrique de l’ADN par différents types de fluorochromes permet de connaître la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle. L’estimation des effectifs dans ces phases dépend du coefficient de variation des pics G0/1 et G2+M mais également de la méthode employée (miroir, gaussiennes,....) via les logiciels d’analyse.

L’analyse biparamétrique permet de s’affranchir des limites de celle du simple contenu en ADN et d’obtenir des informations complémentaires sur le cycle cellulaire pour distinguer les cellules en G0, G1, G2 et M. Elle consiste à combiner la mesure du contenu en ADN avec différents paramètres caractéristiques de la synthèse d’ADN (BrdU - EdU) ou de la présence de protéines particulières, directement associées ou non au phénomène prolifératif (antigène Ki67, histone H3 phosphorylée par exemple).

Cet atelier comprendra :

Références :


7 - Image stream analyse jeu de donnée - Durée de l’atelier : 1h30

Nadège Marec (Nantes)


18 - Atelier Infinicytt - Durée de l’atelier : 1h30

Olivier Muñoz (Rungis)


19 - CytofKit (présentation et applications) - Durée de l’atelier : 1h30

Olivier Molendi-Coste et Pineau Laurent (Lille)

La cytométrie de masse est devenue une technique de référence pour l’étude du phénotype et de la fonctionnalité cellulaire.

L’analyse des données multiparamétriques comme celles issues de la cytométrie de masse peut se réaliser de façon classique. Cependant, le développement d’algorithmes de plus en plus performants d’analyse non supervisée assistée par ordinateur est en plein essor dans la littérature et permet l’identification optimisée des populations/sous-populations rares et d’intérêt.

Parmi ces algorithmes se distinguent deux domaines principaux :

Les algorithmes de réduction de dimension visent à rassembler les événements les plus similaires et représentent ces événements le plus souvent en 2 dimensions. t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) semble être l’algorithme le plus performant pour l’analyse des données de cytométrie.
Les algorithmes de clustering sont nombreux, et, en fonction des jeux de données, présentent des performances variables d’un algorithme à l’autre en terme de regroupement des cellules similaires sur la base des n dimensions sélectionnées, de vitesse d’exécution, et de reproductibilité. L’utilisation de plusieurs algorithmes en parallèle permet de corroborer les résultats obtenus. Parmi ceux-ci, Rphenograph et ClusterX semblent les plus performants pour l’analyse des données de cytométrie.

Le kit « CyotfKit » développé sous « R » regroupe les algorythmes t-SNE, Rphenograph et ClusterX, et nous verrons qu’il est relativement facile d’accès.


20 - R-SHINY utilisation - Durée de l’atelier : 1h30

Quentin Barbier (Marseille)


21 - Atelier Cytobank - Durée de l’atelier : 1h30


22 - Atelier FlowJo - Durée de l’atelier : 1h30

Christop Freier


23 - Atelier Kaluza™ - Durée de l’atelier : 1h30

Benoit Dupont (Villepinte)


25 - Myélodysplasie - Durée de l’atelier : 1h30

Lydia Campos et Carmen Aanei (Saint-Étienne)

Le but de l’atelier est d'assurer une présentation générale sur l’intérêt diagnostique des myélodysplasies par cytométrie en flux et de présenter une nouvelle stratégie d’analyse des données immunophénotypiques des lignées myéloïdes afin de pouvoir intégrer ces données dans le cadre d’un bilan de diagnostic de Syndrome Myélodysplasique (SMD).

Après présentation des données de la littérature et des principes théoriques, les participants pourront visualiser des analyses de cas guidées par des bases de données de moelles normales pour les exercer à identifier des anomalies phénotypiques liées à la dysplasie.

L’objectif est de sensibiliser les participants aux écueils et aux exigences techniques afin d’obtenir des données comparables avec une base de données, ainsi que l’importance de s’appuyer sur des bases de données de moelles normales pour évaluer les anomalies phénotypiques liées à la dysplasie.

La forte demande des cliniciens pour optimiser le diagnostic de SMD est justifiée par la nécessité d’initiation précoce du traitement afin d’assurer l’indépendance transfusionnelle autant que possible, prolonger la survie et améliorer les pronostics de ces patients.


26 - Lymphomes / Myélomes - Durée de l’atelier : 1h30

Mikaël Roussel (Rennes)


27 - Maladie résiduelle cellules souches LAM - Durée de l’atelier : 3h

Adriana Plesa (Lyon), Florent Dumezy (Lille) et Christophe Roumier (Lille)

Les objectifs de cet atelier sont de donner les bases et d’approfondir vos connaissances nécessaires à la réalisation en pratique quotidienne de laboratoire du suivi de la maladie résiduelle des LAM par cytométrie multiparamétrique.


28 - Maladie résiduelle LLC - Durée de l’atelier : 3h

Rémi Letestu (Bobigny)

L’étude de la maladie résiduelle (MRD) prend une place grandissante dans le suivi des patients traités pour une leucémie lymphoïde chronique (LLC). Il y a encore quelques années, cette analyse était considérée comme une étude ancillaire dans les essais cliniques, puis elle a été utilisée comme indicateur de réponse au traitement, sa signification pronostique a été validée dans les essais cliniques, et elle a également servi pour la stratification des patients candidats à un traitement de consolidation.

Actuellement, la valeur pronostique des tests haute sensibilité se confirme après immunochimiothérapie et permet d’envisager son utilisation dans la prise de décision thérapeutique. Le statut de la MRD peut être employé pour poser l’indication d’une ré-intervention thérapeutique mais surtout pour décider de l’interruption d’un traitement au long cours. Cette dernière application est particulièrement importante s’agissant des nouvelles thérapies ciblées comme les inhibiteurs du BCR ou les BH3 mimétiques comme les inhibiteurs de Bcl-2.

Jusqu’à présent, les recommandations stipulent qu’il n’y a pas d’indication à tester la MRD en dehors des essais cliniques. Cependant, l’évolution des pratiques et les nouvelles applications de la MRD suggèrent un passage prochain de ce test dans le domaine des analyses biologiques spécialisées. Dans ce contexte il semble important que des techniques de MRD sensibles et standardisées soient accessibles afin de répondre à une prochaine demande des cliniciens.

Dans cet atelier nous vous proposons une première partie théorique avec un rappel sur les notions de base de la MRD, l’évolution des techniques et de leurs performances, l’interprétation des résultats et leur formulation. Après une petite pause bienvenue, une seconde partie pratique vous proposera une série de cas à analyser afin de vous familiariser avec le profil d’expression des marqueurs de suivi de la LLC et leur fenêtrage. Enfin, nous pourrons réserver un temps d’échange autour de situations pratiques apportées par les participants. Donc, si vous avez des questions relatives à un cas, n’hésitez pas à me les adresser au plus tard le 15 mai à l’adresse suivante remi.letestu@aphp.fr afin que je puisse les préparer à l’avance.

Au plaisir de vous accueillir nombreux dans cet atelier en juin prochain…
Bien cytométriquement vôtre !